熒光顯微鏡是現代生物醫學(xué)研究的“眼睛”，它讓我們能清晰地看到細胞內部精細的結構和動(dòng)態(tài)的生命過(guò)程。這套系統之所以能突破傳統顯微鏡的極限，將不可見(jiàn)的熒光信號轉化為絢麗的圖像，其核心奧秘在于兩大部分：能發(fā)出特定波長(cháng)光線(xiàn)的“激發(fā)光源”和能精準分離信號的“濾光片組”。

（圖源網(wǎng)絡(luò )-侵刪）

熒光顯微鏡的“太陽(yáng)”——常見(jiàn)激光激發(fā)光源分析

熒光顯微鏡的原理是使用高能量（短波長(cháng)）的光去照射熒光探針（染料或熒光蛋白），使其受激躍遷并釋放出較低能量（長(cháng)波長(cháng)）的熒光。因此，一個(gè)穩定、純凈且強大的光源至關(guān)重要。激光因其單色性好、亮度高、準直性佳等優(yōu)點(diǎn)，成為高端熒光顯微鏡（尤其是共聚焦、超分辨顯微鏡）的首選光源。

（熒光顯微鏡常規光學(xué)元件應用圖）

最常見(jiàn)的幾種激光器及其應用領(lǐng)域：

1.紫外激光（~405nm）：

應用：常用于激發(fā)DAPI、Hoechst等藍色熒光染料，用于細胞核染色。此外，在光激活、光轉換（如PA-GFP）等超分辨技術(shù)中也有重要應用。

特點(diǎn)：能量高，但可能引起較強的光毒性和光漂白。

（NBP405窄帶激發(fā)濾光片）

2.藍色激光（~488nm）：

應用：這是使用最廣泛的激光之一。它是綠色熒光蛋白（GFP）和FITC、AlexaFluor488等綠色熒光染料的標準激發(fā)光源。

特點(diǎn)：亮度高，穩定性好，是細胞結構標記和動(dòng)態(tài)示蹤的基石。

（NBP488激發(fā)濾光片）

3.綠色激光（~561nm）：

應用：專(zhuān)門(mén)用于激發(fā)mRFP、DsRed、Cy3、TRITC等發(fā)射黃色或橙色熒光的探針。它能有效避免使用488nm激光時(shí)可能帶來(lái)的串色（Crosstalk）問(wèn)題。

特點(diǎn)：為多色標記實(shí)驗提供了關(guān)鍵的激發(fā)通道。

（BP綠光激發(fā)濾光片）

4.紅色激光（~640nm）：

應用：主要激發(fā)遠紅染料，如Cy5、AlexaFluor647等。這些染料在細胞自發(fā)熒光背景較低的區域發(fā)射，信噪比極高，常用于多色標記中的第四個(gè)或第五個(gè)通道，也是許多超分辨顯微鏡技術(shù)（如STORM）的核心。

特點(diǎn)：穿透性稍好，光毒性相對較低。

（BP640激發(fā)濾光片）

5.近紅外激光（~785nm）：

應用：主要用于激發(fā)特殊的紅外染料，或作為受激拉曼散射（SRS）顯微鏡的光源，進(jìn)行無(wú)標記化學(xué)成像。

特點(diǎn)：生物組織對近紅外光吸收和散射少，穿透深度大，適用于活體成像。

（紅外BP785激發(fā)濾光片）

光影的“指揮官”——濾光片組的技術(shù)剖析

僅有光源是不夠的。樣本被激發(fā)后，會(huì )同時(shí)產(chǎn)生我們想要的發(fā)射熒光和強大的激發(fā)光散射光，后者比前者要強幾個(gè)數量級。如果不能將其精確分離，我們將看不到任何熒光信號。這時(shí)，就需要由三塊濾光片組成的“濾光片立方體（FilterCube）”來(lái)?yè)巍爸笓]官”的角色。

1.激發(fā)濾光片（ExcitationFilter,Ex）：

功能：放置在光源后，只允許特定波長(cháng)的激發(fā)光通過(guò)，像一道“光閘”，確保只有能有效激發(fā)目標染料的光線(xiàn)能照射到樣本上。

激發(fā)濾光片相關(guān)參數指標：

中心波長(cháng)（CWL）：必須與激光器的輸出波長(cháng)完美匹配（如488nm激光配CWL=488nm的濾光片）。

帶寬（FWHM）：通常偏窄（如10-30nm），以確保激發(fā)光的單色性，避免激發(fā)非目標染料。

峰值透過(guò)率（Tpeak）：>90%，甚至>95%，最大限度地利用寶貴的光源能量，降低照明時(shí)間，減少光損傷。

阻擋范圍（BlockingRange）：需在發(fā)射熒光所在的波段（如500-700nm）有極高的截止深度（OD>5-6），防止任何雜光進(jìn)入后續光路。

2.二向色鏡（DichroicMirror,DM）：

功能：位于光路45度角，是一面特殊的分光鏡。它根據波長(cháng)進(jìn)行反射和透射：反射激發(fā)光使其垂直向下照亮樣本，透射發(fā)射熒光使其進(jìn)入探測器。

（熒光透藍反綠二向色鏡）

二向色鏡參數指標：

分光閾值（Cut-on/Cut-offWavelength）：這是最重要的參數。設計必須精確，以確保對激發(fā)光（如488nm）的反射率（R）>99%，同時(shí)對發(fā)射光（如510nm以上）的透過(guò)率（T）>90%。

過(guò)渡區斜率（Slope）：閾值處的曲線(xiàn)越陡峭越好，意味著(zhù)分光越徹底，信號分離效果越佳。

通帶透過(guò)率與阻帶阻擋率：同樣要求通帶高透，阻帶高反（高阻）。

（BP525帶通濾光片）

3.發(fā)射濾光片（EmissionFilter,Em）：

功能：放置在探測器前，是最后的“質(zhì)檢員”。它只允許樣本發(fā)出的特定波長(cháng)的熒光通過(guò)，并堅決阻擋任何殘留的激發(fā)散射光。

廠(chǎng)家視角（參數指標）：

中心波長(cháng)與帶寬：根據目標熒光的發(fā)射光譜確定（如收集GFP發(fā)射光，CWL=525nm，帶寬~30-50nm）。

阻擋特性（Blocking）：這是發(fā)射濾光片的靈魂所在。必須在激發(fā)光波長(cháng)處（如488nm）具有極高的截止深度（OD>5，即允許透過(guò)的光小于百萬(wàn)分之一），這是獲得高對比度、低背景圖像的關(guān)鍵。通常標注為“OD6@488nm”。

從廠(chǎng)家角度看，一套優(yōu)秀的濾光片組，不僅僅是三個(gè)獨立的高性能濾光片，更是一個(gè)高度協(xié)同的系統。三者的參數必須根據用戶(hù)選擇的激光器和熒光探針進(jìn)行聯(lián)動(dòng)設計和匹配，任何一塊的性能短板都會(huì )導致整個(gè)成像系統的失敗。

（熒光顯微鏡-圖源網(wǎng)絡(luò )，侵刪）

熒光顯微鏡的成像之旅，是一場(chǎng)光與物質(zhì)相互作用后，被精密光學(xué)系統精準捕獲的完美協(xié)作。激光光源提供了強大而純凈的初始能量，定義了能夠被觀(guān)察的“顏色種類(lèi)”；而濾光片組則是幕后英雄，憑借其納米級鍍膜技術(shù)帶來(lái)的精確波長(cháng)控制能力，完成了從強噪聲中提取弱信號這一近乎不可能的任務(wù)，定義了圖像的“清晰度和可信度”。

作為光學(xué)鍍膜廠(chǎng)家，我們深知每一片濾光片都不只是一片玻璃，而是承載著(zhù)研究人員對揭示生命奧秘的期待。我們追求的高透過(guò)率、高截止深度、陡峭的過(guò)渡區和卓越的環(huán)境穩定性等優(yōu)秀指標，直接轉化為顯微鏡圖像更高的亮度、更低的背景、更優(yōu)的信噪比和更長(cháng)的使用壽命。正是這些看似微小的參數提升，共同推動(dòng)了前沿科學(xué)研究邊界的不斷拓展，讓人類(lèi)洞察微觀(guān)世界的能力達到了前所未有的高度。